在高效液相色谱（HPLC）分析领域，许多小伙伴可能都遇到过一些色谱柱“非正常死亡”事件，比如：一根性能良好的C18色谱柱，在分析化合物后，分离效果悄然变差，系统压力莫名升高，最终甚至彻底堵塞。经过繁琐的排查，往往会发现问题的根源除了是因为色谱柱本身性能较差，也很可能源于流动相的选择不当——如：过高的碱性流动相导致硅胶基质逐渐溶解等...总之，类似“事故”层出不穷！

流动相选择与使用原理

今天，我们就一起深入探讨一下流动相选择与使用的原理，让我们的实验不再天天靠“仪器心情”~

1 流动相的核心使命

流动相在液相色谱中扮演着四个不可替代的角色：

□ 溶剂角色：

充分溶解样品，防止在进样端析出导致柱堵塞。

□ 驱动力角色：

通过泵输送，提供分离过程所需的能量流。

□ 分配伙伴角色：

与固定相共同构建分配平衡，决定组分迁移速率。

□ 检测兼容角色：

满足检测器的物理化学要求。

2 流动相的“动态三角”

# 水相：pH是“酸碱跷跷板”#

在开头举例的这类“事故悲剧”中，大多是由于水相pH不当引起；水相不仅是稀释剂，更是pH控制的T台。对可离子化化合物而言，pH调整是最强大的分离工具。

□ 基本法则：

对于弱酸（如有机酸），降低pH可抑制解离，增加其在反相柱上的保留；对于弱碱（如生物胺），提高pH可促进其以中性分子形式存在，同样增加保留。pH通常应控制在目标化合物pKa ± 1.5范围内，以获得可预测的保留行为。

小Tips：缓冲浓度通常10-50 mM为宜。过高易结晶，过低则缓冲能力不足。

# 有机相：溶剂强度的“调节旋钮”#

在反相色谱中，有机相比例是控制保留时间的主要变量。

□ 不同有机溶剂提供不同的选择性：

甲醇：质子给体，氢键作用强，价格低廉但黏度较高。

Y腈：中等偶极矩，选择性不同，黏度低，紫外截止波长低，但毒性较高。

四氢呋-喃：强洗脱能力，独特选择性，但易氧化，稳定性差。

小Tips：在设计梯度时：有机相比例变化应平滑，避免剧烈变化导致基线漂移或柱压不稳。初始比例通常从5-10%开始，根据化合物疏水性逐步增加。

# 改性剂：分离选择的“秘密武器”#

□ 特殊添加剂可解决特定分离问题：

离子对试剂：如三氟乙-酸（TFA，0.1%常用）用于改善碱性化合物峰形，烷基磺酸盐用于保留阳离子。

手性选择剂：环糊精等，用于对映体分离。

金属螯合剂：如EDTA，用于防止金属离子干扰。

小Tips：添加剂可能吸附于固定相，改变柱性质。使用后需充分冲洗，建议使用专用柱进行含添加剂的实验。

3 流动相使用的“仪式感”

□ 流动相的配制流程请遵守严谨的“仪式”：

精确计算 →按顺序配制→pH测量校正→过滤与脱气→标签与记录。

小Tips：水相缓冲液建议现配现用，含盐流动相最长不超过一周（冷藏）；纯水-有机相混合物保质期可延长，但仍建议定期更换。

4 当流动相成为“问题源”

□ 许多色谱异常可追溯至流动相问题：

压力异常升高：

可能源于未过滤的颗粒物、微生物滋生或盐结晶。检查过滤步骤，确保流动相新鲜。